VALUTAZIONE DI ATTIVITÀ ENZIMATICHE ORGANO-SPECIFICHE IN CONIGLI ALIMENTATI CON SOIA TRANSGENICA
Mastellone V., d’Angelo D., Pero M.E., Pelagalli A., Lombardi P., Avallone L.

Dipartimento di Strutture, Funzioni e Tecnologie Biologiche, Università di Napoli Federico II

Summary
The effects of genetically modified soybean feeding were evaluated in rabbits. Several enzymes were assayed in serum and tissue homogenates (hearth, skeletal muscle, liver, kidney) in order to reveal possible organ-specific alterations. Within the enzymes tested, lactic dehydrogenase showed significant differences in hearth and kidney. The electrophoretic analysis of LDH isoenzymes showed that LDH1 was increased in rabbit fed with GM soybean and such increase was detected also in liver. Our results showed that, despite no clinical and/or serum biochemical alteration can be detected in rabbits fed with GM soybean, a modification of LDH activity was seen, thus suggesting that the potential metabolic effects of GM feeding merits further studies.

Parole Chiave – coniglio, enzimi, soia transgenica

Introduzione
La modoficazione genetica degli alimenti di origine vegetale è uno strumento utile per migliorarne caratteristiche specifiche. I principali obiettivi sono stati, fino ad oggi, l’incremento della produzione e la resistenza alle malattie ed agli erbicidi. L’ingegneria genetica ha trovato ampia applicazione nel campo dell’agricoltura, e numerosiorganismi geneticamente modificati (OGM) sono stati creati tramite inserimento di nuovi geni nel genoma originale (Aumaitre et al. 2002). Per quanto riguarda i possibili effetti degli OGM sulla salute, allergia e tossicità rappresentano i rischi accertati ma la letteratura in questo campo risulta ancora molto scarsa. I pochi studi effettuati su tale argomento suggeriscono l’assenza di effetti negativi sul metabolismo di animali alimentati con diete transgeniche e, di conseguenza, escludono potenziali rischi per l’uomo. Di contro, alcuni autori hanno dimostrato che frammenti di DNA vegetale possono essere isolati da organi e tessuti animali; il che suggerisce che il DNA delle piante non sia completamente degradato durante la digestione e potrebbe teoricamente integrarsi con il DNA animale (Chowdhury EH et al. 2003). L’obiettivo di questa ricerca è stato quello di valutare i possibili effetti organo-metabolici indotti da una dieta geneticamente modificata. A tal scopo è stata valutata l’attività di alcuni enzimi nel siero e nei tessuti di conigli alimentati con soia transgenica.

Materiali e metodi
L’indagine è stata effettuata su 20 conigli bianchi New Zeland (BNZ) equamente distribuiti tra i sessi, suddivisi in due gruppi omogenei di 10 animali ciascuno. Entrambi i gruppi sono stati alimentati (130 g/die), con una dieta costituita per l’80% da un mangime completo (farina di erba medica disidratata, girasole f.e., frumento, carrube denocciolate, tritello f.t., polpe di barbabietola essiccate, orzo) e per il 20% da farina di estrazione di soia. Per il gruppo di controllo (C) è stata utilizzata soia convenzionale, mentre al secondo gruppo (T) è stata somministrata una soia RoundUp Ready (RR), caratterizzata dalla presenza del gene epsps (codificante per l’enzima 5 – enolpiruvato – 3 - fosfoscikimato acido sintasi), isolato dall’Agrobacterium tumefaciens ceppo CP4, in grado di rendere la pianta resistente all’azione degli erbicidi glifosati. L’acqua è stata somministrata ad libitum. I conigli sono stati sacrificati a 70±0,5 giorni di età (2±0,09 kg di peso vivo).
Campionatura - Il sangue è stato prelevato dalla vena giugulare prima della macellazione, posto in provetta e centrifugato a 2500 x g. Campioni di fegato, muscolo, rene e cuore sono stati lavati in soluzione salina e conservati a –20°C.
Analisi enzimatica – L’attivitàdi AST, ALT, CK, GGT, ALP ed LDH è stata valutata nel siero ed in omogenati di tessuto. A tal scopo, un grammo di tessuto è stato posto in un buffer contenente (in mM): 280 mannitolo, 10 KCL 1 MgCl2, 0,2 Pefabloc SC, 10 Hepes, e successivamente portato a pH 7.0 con Tris (Thevenod et al, 1999). I campioni sono stati omogenati (Ultra-Turrax) e successivamente centrifugati (ultracentrifuga Beckman L7) a 10000 x g per 10 minuti; il surnatante è stato utilizzato per le analisi. Le attività enzimatiche totali sono state determinate spettrofotometricamente utilizzando reagenti della Spinreact SA.

Per quanto riguarda la LDH, è stata anche effettuata una elettroforesi su acetato di cellulosa per valutare le diverse frazioni isoenzimatiche (Avallone L et al. 1996). In sintesi, venivano utilizzati 20ml di campione alle seguenti condizioni di migrazione: 200 V per 50 minuti in buffer barbitale.

Statistica - I risultati sono stati espressi come media±deviazione standard. Le differenze nei livelli enzimatici tra i gruppi sono state analizzate utilizzando lo Student’s T test.

Risultati
Le attività enzimatiche sieriche nei due gruppi non hanno mostrato differenze significative. La figura che segue mostra i livelli enzimatici riscontrati nel cuore, muscolo scheletrico, rene e fegato. Differenze statisticamente significative (P£ 0,05) sono state rilevate nel rene per ALT, GGT ed LDH .


 


Quest’ultima risultava statisticamente aumentata anche nel cuore dei conigli alimentati con soia transgenica. Nessuna differenza statistica è stata trovata nel fegato e nel muscolo scheletrico.

La tabella seguente mostra la distribuzione relativa agli isoenzimi LDH nel siero e nei tessuti.





Differenze significative (P£ 0,05) tra il gruppo di controlloe quello trattato sono state evidenziate per il cuore (LDH1 e LDH2), per il rene (LDH1) e per il fegato (LDH1 e LDH4).


Discussione
L’uso di piante geneticamente modificate per l’alimentazione animale è stata autorizzata in molti paesi, ma ancora molti sono i dubbi riguardanti la sicurezza di geni e proteine estranee espresse nelle piante mediante la tecnica del DNA ricombinante. I livelli degli enzimi nel siero non hanno mostrato differenze significative, il che sembrerebbe indicare l’assenza di sofferenze di organo negli animali trattati. Tale risultato è in linea con quegli autori che affermano che l’alimento GM può essere utilizzato per l’alimentazione animale o umana senza significativi rischi per la salute. Di contro, le analisi enzimatiche relative alle attività tessutali mostrano un quadro differente. Come riportato nei risultati, le differenze significative si riscontravano principalmente nel rene, mostrando livelli più elevati di LDH, ALT e GGT negli animali trattati. La mancata alterazione dei livelli sierici non permette di rilevare un danno cellulare ma, piuttosto, consente di ipotizzare una alterazione del metabolismo cellulare a livello renale. Inoltre, la LDH è risultata significativamente aumentata anche nel cuore, ancora una volta in presenza di concentrazioni sieriche fisiologiche. La distribuzione degli isoenzimi LDH conferma questo risultato, mostrando differenze significative per LDH1 e LDH2 nel cuore e LDH1 nel rene. Inoltre, un significativo aumento di questo isoenzima è stato anche rilevato nel fegato, nonostante non fossero state trovate differenze significative per l’attività totale dell’enzima in questo organo.
L’attività della LDH1, quindi, è risultata significativamente aumentata in tre degli organi testati. La LDH1 (H4) favorisce la conversione del lattato in piruvato ed è presente a livello del reticolo sarcoplasmatico, in prossimità dei granuli di glicogeno, ed a livello della membrana mitocondriale. La formazione intracellulare del lattato, invece, è attribuita alla LDH5. L’aumento esclusivo della LDH1, quindi, potrebbe indicare una maggiore necessità di conversione in piruvato destinato poi all’utilizzazione mitocondriale.
Nel loro complesso, i risultati indicano una maggiore sintesi di LDH1 e quindi, potenzialmente, una diversa espressione del gene che ne codifica la formazione. Attribuire tale risultato ad un’alterazione genica indotta da una integrazione di frammenti di DNA geneticamente modificato sarebbe chiaramente una ipotesi azzardata ma, sicuramente, i dati suggeriscono che lo studio degli effetti metabolici degli OGM richiede indagini più approfondite. A sostegno di questa tesi, ricordiamo che altri autori hanno mostrato che, in seguito a diete OGM, è possibile rilevare significative modificazioni ultrastrutturali dei componenti nucleari generalmente attribuibili ad un incremento del metabolismo cellulare (Malatesta et al, 2002).
In conclusione, i nostri risultati indicano che gli animali alimentati con soia GM, pur non evidenziando segni clinici evidenti o significative alterazioni dei profili metabolici, hanno mostrato un’alterazione nella produzione tissutale di alcuni organi di LDH, suggerendo che la ricerca sui possibili effetti metabolici di una dieta GM debba essere approfondita. In questo senso, i nostri risultati suggeriscono che potrebbero essere utile, per rilevare gli effetti della dieta OGM sul metabolismo cellulare anche in assenza di segni clinici e biochimici, protocolli sperimentali che prevedano, in questa specie, periodi di diete GM più protratti.



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Bibliografia

Avallone L et al. Age-dependent variations of lactate dehydrogenase and creatine kinase activities in water buffalo calf serum. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34(12):961-4, 1996.

Aumaitre A et al. New feeds from genetically modified plants: substantial equivalence, nutritional equivalence, digestibility, and safety for animals and the food chain. Livestock Product Sci 74, 3, 223-238, 2002.

Chowdhury EH et al. Detection of corn intrinsic and recombinant DNA fragments and Cry1Ab protein in the gastrointestinal contents of pigs fed genetically modified corn Bt11. J Anim Sci. 81(10):2546-51, 2003.

Malatesta M et al. Ultrastructural morphometrical and immunocytochemical analyses of hepatocyte nuclei from mice fed on genetically modified soybean. Cell Struct. Funct. 27(4):173-80, 2002.